ПЛР: 5 компонентів реакційної суміші і 4 етапи перебігу реакції

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – є сучасним методом діагностики, що дозволяє проводити ідентифікацію збудника інфекційного захворювання, наприклад, за його нуклеїнової кислоти.

Як проводиться оцінка методу діагностики?

ПЛР діагностика на сьогоднішній день є «золотим стандартом» в області медицини. За допомогою цього методу можна виявити різні інфекції, найбільш часто визначаються є:

  • статеві інфекції;
  • туберкульоз;
  • цитомегаловірус;
  • ВІЛ;
  • гепатити;
  • герпес;
  • і багато інших.

Крім ПЛР діагностики інфекцій, цей метод використовується в криміналістиці для встановлення родинних зв’язків, в генетиці.

ПЛР універсальна, дозволяє виявити будь-яку послідовність, має 100% специфічність, так як визначається послідовність унікальна для певного виду мікроорганізму. Завдяки різним удосконаленням можна визначити кількість нуклеиновый кислоти, наприклад, таким чином оцінюється вірусне навантаження у осіб з гепатитами, що допомагає вибрати тактику лікування.

Для аналізу досить невеликої кількості вихідного матеріалу, що є величезним плюсом у роботі криміналістів і судмедекспертів.

загрузка...

ПЛР не вимагає тривалого часу, як бакпосев, її вартість порівнянна з іншими лабораторними тестами.

Однак для отримання достовірних результатів необхідний високий рівень професіоналізму і точне дотримання техніки виконання.

Нуклеїнова кислота

В залежності від типу збудника в його організмі може бути присутнім ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) або РНК (рибонуклеїнова кислота). Мономерами в будові нуклеїнової кислоти є азотисті підстави: пуринові – аденін (А), гуанін (Г), пиримидиновые – цитозин (Ц), урацил (У), тимидин (Т). До них приєднується вуглевод – рибоза або дезоксирибоза і залишок фосфорної кислоти. У такому складі вони утворюють ланцюг нуклеїнової кислоти.

Важливою особливістю є будова ДНК. Вона має спірально-закручене двухцепочечное будова: на одного ланцюга шикуються азотисті основи, на другий вони шикуються за принципом комплементарності до першої.

Комплементарними підставами є:

  • аденін – тимін;
  • цитозин – гуанін.

Вони з’єднуються між собою водневими зв’язками, що забезпечують міцність молекули.

Реплікація

Метод полімеразної ланцюгової реакції заснований на багаторазовому збільшенні кількості певного ділянки ланцюга нуклеиновый кислоти. В основі цього лежить такий процес, як реплікація – синтез нуклеотидів за матричної ланцюга згідно з принципом комплементарності.

Читайте також:  Скільки дійсна флюорографія, термін дії результатів дослідження

Історична довідка

У 1983-му Кері Мюлліса створив метод, який в штучних умовах за допомогою ферменту дозволив виділити ділянку ДНК в ході циклів подвоєнь. За відкриття ПЛР у 1993-му році він отримав Нобелівську премію.

Склад реакційної суміші

  1. Taq-ДНК-полімераза. Забезпечує синтез ланцюга ДНК зі швидкістю до тисячі пар основ в хвилину. Є термостабильной, активна при 72°С.
  2. Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP). Шикуються в нову ланцюг згідно з принципом комплементарності. Їх не повинно бути в надлишку, так як це може привести до неправильного приєднання при ПЛР.
  3. Праймери. Вони являють собою короткі ділянки нуклеїнової кислоти (олигонуклеотид), які допомагають у подальшому проводити синтез дочірньої ланцюга ДНК. Враховуючи, що вони вбудовуються в фрагменти ДНК, їх повинно бути в надлишку.
  4. Буферна система. Її склад забезпечує оптимальну роботу і високий вихід продукту реакції. Розчин солей підтримує необхідний рівень рН. Іони магнію, зв’язуючись з дезоксинукелотидами, є субстратами для полімерази. Бичачий сироватковий альбумін запобігає прилипання суміші в стінках пробірок.
  5. ДНК-матриця. Вихідної ДНК не повинно бути у великій кількості, щоб не знизилася чутливість і ефективність ПЛР.

Якщо в якості матриці використовується молекула РНК, то необхідно вносити додатково спеціальний фермент – РНК-залежну ДНК-полімеразу (зворотна транскриптаза, ревертаза), яка синтезує комплементарну їй ланцюг ДНК, що вважається в подальшому матрицею в ПЛР.

Метод ПЛР

Метод ПЛР проводиться у 20 – 45 циклів, кожен з яких включає стадії:

  • денатурація;
  • віджиг праймерів;
  • елонгація.

Всі три стадії протікають з різною температурою (таблиця 1), тому необхідний спеціальний прилад, який чітко регулює температурний режим – ампліфікатор.

Таблиця 1. Температурний режим стадій ПЛР.

Стадія Температура
Денатурація 94 – 96°С
Віджиг праймерів 40 – 60°С
Елонгація 72°С

Денатурація

Щоб вважати послідовність азотистих основ в молекулі ДНК, необхідно її розкрутити, тобто під денатурацією розуміють розбіжність ланцюгів молекули в результаті певного впливу (висока температура, рН).

При нагріванні до 94 – 96°С до 1,5 хвилин ланцюга ДНК розходяться.

Віджиг праймерів

На цій стадії відбувається комплементарне зв’язування праймерів з матричної ланцюгом ДНК, які, таким чином, обмежують необхідний для реплікації ділянку. Температура цій стадії становить 40 – 60°С і триває не більше 1 хвилини.

Читайте також:  УЗД: 7 областей діагностики та особливості впливу ультразвуку на організм

Елонгація

Суть стадії елонгації полягає в синтезі нової дочірньої ланцюга ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази, яка забезпечує утворення нової структури по обмеженому праймерами ділянці.

Температура проведення елонгації залежить від ДНК-полімерази. Наприклад, Taq-полімераза стабільна при 72°С. Тривалість стадії залежить від розміру копируемого ділянки, зазвичай припадає близько 1-ї хвилини на 1000 пар основ.

Кількість продукту, утвореного в результаті ПЛР, в теорії зростає в геометричній прогресії: 1 молекула ДНК дає початок двом іншим, а ті в подальшому точно також. Це можна обчислити за формулою:

А = 2 n , де А – кількість продукту, n – кількість циклів реакції.

Більше 45 циклів проводити не рекомендується, так як утворюються побічні продукти реакції.

Детекція

Для аналізу отриманої амплифицированной ДНК використовуються різні методи детекції: гель-електрофорез (агарозный, полиакриламидный), гібридизації по Саузерну. Більш точні результати відомі при секвенировании – визначення послідовності нуклеотидів у ланцюзі.

Може використовуватися нуклеотидний зонд, який мітить флуоресцеином, проявляється в реакції электрохемилюминесценции або за допомогою моноклональних антитіл.

ПЛР у реальному часі

В сучасних лабораторіях використовується поліпшена версія – ПЛР в режимі реального часу. В реакційну суміш додається флуоресцентний зонд або интеркалирующий барвник, що дозволяє оцінювати явище флуоресценції кожен цикл. Це забезпечує кількісну характеристику утвореного продукту в пробірці, яка відображається на графіку.

Можна вносити кілька зондів, що дозволяє проводити детекцію декількох продуктів реакції.

Контамінація

Під контамінацією розуміють забруднення реакційної суміші речовинами з навколишнього середовища, що може призвести до псевдопозитивного результату в оцінці. Щоб цього не відбувалося, є ряд правил:

  • використання чистих рукавичок;
  • одноразові пробірки;
  • одноразові наконечники;
  • проведення обробки поверхні столів і приладів;
  • УФ-обробка приміщення;
  • поділ ПЛР-лабораторії на зони.

Для точності методу завжди разом з дослідними пробами ставиться позитивний і негативний контроль. Також проводяться дослідження змивів з поверхонь для оцінки чистоти поверхонь.

Висновок

Полімеразна ланцюгова реакція має важливе значення в діагностиці захворювань (інфекційних, спадкових, пухлинних, неінфекційних), в фармакогенетике (вплив генів на метаболізм лікарського засобу), встановлення особи, родинних зв’язків, генної інженерії, археології, сільському господарстві та інших областях. Завдяки цьому методу ми змогли зробити крок вперед, він неймовірний за своїми можливостями і ще немає кінця розкритого потенціалу.

Читайте також:  ЕЕГ головного мозку дитини: що показує енцефалограма голови у дітей, що це таке
загрузка...
diagnoz.in.ua